5.3 Cambios bacteriológicos

La flora bacteriana en peces vivos

Los microorganismos se encuentran en todas las superficies externas (piel y branquias) y en los intestinos de los peces vivos y recién capturados. El número total de microorganismos varía enormemente, Liston (1980) establece como rango normal 10² - 10⁷ ufc (unidades formadoras de colonias)/cm² en la superficie de la piel. Las branquias e intestinos contienen entre 10³ y 10⁹ ufc/g (Shewan, 1962).

La flora bacteriana en pescados recién capturados depende más del medio ambiente de captura, que de la especie (Shewan, 1977). Los pescados capturados en aguas muy frías y limpias contienen menor número de microorganismos, mientras que el pescado capturado en aguas cálidas presenta recuentos ligeramente superiores. Números muy elevados, por ejemplo 10⁷ ufc/cm², se encuentran en pescados capturados en aguas muy contaminadas. Muchas especies diferentes de bacterias pueden ser encontradas en la superficie de los peces. Las bacterias en peces de aguas templadas son clasificadas en psicrotrófas y psicrófilas, de acuerdo al rango de su temperatura de crecimiento. Las psicrotrófas (tolerantes al frío) son bacterias capaces de crecer a 0 °C pero su óptimo es alrededor de los 25 °C. Las psicrófilas (amantes del frío) son bacterias con una temperatura máxima de crecimiento alrededor de los 20 °C y su óptimo a 15 °C (Morita, 1975). En las aguas cálidas pueden aislarse un mayor número de mesófilos. La microflora en peces de aguas templadas está dominada por bacterias psicrófilas Gram negativas con forma de bastones, pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Shewanella y Flavobacterium. Miembros de las Vibrionáceas (Vibrio y Photobacterium) y Aeromonadáceas (Aeromonas spp.) son también bacterias acuáticas comunes y típicas de la flora bacteriana en pescado (Cuadro 5.4). Organismos Gram positivos como Bacillus, Micrococcus, Clostridium, Lactobacillus y coryneformes también pueden ser encontrados en distintas proporciones. Pero en general, las bacterias Gram-negativas dominan la microflora. Shewan (1977) concluyó que las bacterias Gram-positivas Bacillus y Micrococcus dominaban la microflora en pescados de aguas tropicales. Sin embargo, esta conclusión fue confrontada posteriormente por varios estudios en los cuales se encontró que la flora, en especies de peces tropicales, es muy similar a la flora en especies templadas (Acuff et al., 1984; Gram et al., 1990; Lima dos Santos 1978; Surendran et al., 1989). En algunos estudios realizados en la India se ha encontrado una microflora compuesta por Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella y Vibrio en pescado recién capturado (Surendran et al., 1989). Algunos autores, como Liston (1980), concluyen que la microflora de los peces tropicales a menudo contiene una carga ligeramente mayor de bacterias Gram-positivas y bacterias entéricas, pero por lo demás es similar a la flora de los peces de aguas templadas.

Las Aeromonas spp. son típicas de los peces de agua dulce, mientras que otras bacterias requieren sodio para su crecimiento y, por lo tanto, son típicas de aguas marinas. Este grupo incluye Vibrio, Photobacterium y Shewanella. Sin embargo, a pesar de que Shewanella putrefaciens se caracteriza como dependiente de sodio, también pueden aislarse cepas de S. putrefaciens, a partir de ambientes de agua dulce (DiChristina y DeLong, 1993; Gram et al; 1990; Spanggaard et al., 1993). A pesar de que S. putrefaciens ha sido aislada de aguas dulces tropicales, no resulta de importancia en el deterioro del pescado de agua dulce (Lima dos Santos, 1978; Gram, 1990).

Cuadro 5.4 Flora bacteriana de pescado capturado en aguas limpias no contaminadas

Gram-negativas	Gram-positivas	Comentarios
Pseudomonas	Bacillus
Moraxella	Clostridium
Acinetobacter	Micrococcus
Shewanella putrefaciens	Lactobacillus
Flavobacterium	Coryneformes
Cytophaga
Vibrio		Vibrio y Photobacterium son típicas de aguas marinas;
Photobacterium
Aeromonas		Aeromonas es típica de agua dulce

En aguas contaminadas, puede encontrarse un elevado número de Enterobacteriáceas. En aguas limpias y templadas, estos organismos desaparecen rápidamente, pero se ha demostrado que Escherichia coli y Salmonella pueden sobrevivir por períodos bastante prolongados de tiempo en aguas tropicales y una vez introducidos en el ambiente, se convierten casi que en autóctonos (Fujioka et al., 1988).

La taxonomía de S. putrefaciens ha sido algo confusa. El organismo fue originalmente asociado con el grupo Achromobacter, pero posteriormente colocado en el grupo IV de Shewan Pseudomonas. Tomando como base el porcentaje de guanina + citosina (GC%) se le transfirió al género Alteromonas, pero sobre la base de la homología del 5SRNA se le clasificó en un nuevo género, Shewanella (MacDonnell y Colwell, 1985). Recientemente se ha sugerido que el género Aeromonas spp., un miembro de la familia de las Vibrionáceas, sea transferido a su propia familia, la Aeromonadáceas (Colwell et al., 1986).

Estudios japoneses, han mostrado la presencia de un número muy elevado de microorganismos en el tracto gastrointestinal del pescado, inclusive superior al de las aguas circundantes; esto indica la presencia de un nicho ecológico favorable para los microorganismos. Igualmente, Larsen et al. (1978) reportan hasta 10⁷ ufc/g de organismos parecidos al Vibrio en el tracto intestinal del bacalao, Westerdahl et al. (1991) también aislaron un elevado número de microorganismos parecidos al Vibrio de los intestinos de lenguados. Photobacterium phosphoreum puede ser aislado de la superficie externa y también puede ser aislado en un elevado número del tracto intestinal de algunas especies de pescado (Dalgaard, 1993). Por el contrario, algunos autores consideran que la microflora del tracto gastrointestinal es meramente un reflejo del medio ambiente y de la ingesta.

Invasión microbiana

El músculo de un pez saludable o de un pescado recién capturado es estéril, debido a que el sistema inmunológico del pez previene el crecimiento de bacterias en el músculo (Figura 5.8^a). Cuando el pez muere, el sistema inmunológico colapsa y las bacterias proliferan libremente. En la superficie de la piel, las bacterias colonizan en una amplia extensión la base de las escamas. Durante el almacenamiento, las bacterias invaden el músculo penetrando entre las fibras musculares. Murray y Shewan (1979), encontraron que sólo un número muy limitado de bacterias invade el músculo durante el almacenamiento en hielo. Ruskol y Bendsen (1992) mostraron mediante exámenes microscópicos que las bacterias pueden ser detectadas en el músculo cuando el número de microorganismos en la superficie de la piel incremente por encima de las 10⁶ ufc/cm² (Figura 5.6 b). Este resultado fue observado tanto en el almacenamiento en hielo como en ambiente refrigerado. No se encontró diferencia entre los patrones invasivos de las bacterias específicas del deterioro (por ejemplo S. putrefaciens) y las bacterias no específicas del deterioro.

Dado que sólo un número limitado de microorganismos realmente invade el músculo y el crecimiento microbiano se lleva a cabo principalmente en la superficie, el deterioro es probablemente una consecuencia de la difusión de enzimas bacterianas hacia el interior del músculo y de la difusión externa de nutrientes.

El pescado se deteriora a velocidades muy diferentes (véase también Sección 6.5) y se ha propuesto como explicación las diferencias en las propiedades de la superficie del pescado. Las pieles de los peces tienen texturas muy diferentes. Así, el merlán (Merlangius merlangus) y el bacalao (Gadus morhua) que tienen una cubierta muy frágil se deterioran rápidamente en comparación con algunos peces planos como la solla, que posee una dermis y una epidermis robusta. Además, este último grupo cuenta con una gruesa cubierta de mucus, que contiene algunos compuestos antibacterianos, como anticuerpos, complementos y enzimas bacteriolíticas (Murray y Fletcher, 1976; Hjelmland et al., 1983).

Figura 5.8 Sección histológica de: (a) bacalao recién capturado

Figura 5.8 Sección histológica de: (b) filetes de bacalao almacenado 12 días en hielo. La sección fue tratada con tintura de Giemsa (Ruskol y Bendsen, 1992).

Cambios en la microflora durante el almacenamiento y deterioro/Organismos específicos del deterioro

Las bacterias presentes en pescados capturados en aguas templadas, entran en fase exponencial de crecimiento casi inmediatamente después de la muerte del pez. Esto también ocurre cuando el pescado es colocado en hielo, probablemente porque la microflora se encuentra adaptada a las temperaturas de enfriamiento. Durante el almacenamiento en hielo, la población bacteriana se duplica en aproximadamente 1 día y después de 2 o 3 semanas alcanza unas 10⁸ - 10⁹ ufc, por gramo de músculo o cm de piel. Durante el almacenamiento a temperatura ambiente, se alcanza un nivel ligeramente inferior a las 10 - 108 ufc/g en 24 horas. Las bacterias presentes en pescados provenientes de aguas tropicales generalmente atraviesan por una fase de latencia de 1 a 2 semanas, cuando el pescado se almacena en hielo, y posteriormente se inicia el crecimiento exponencial. Durante el deterioro, el nivel de bacterias en pescados de aguas tropicales es similar al nivel encontrado en especies de aguas templadas (Gram, 1990; Gram et al, 1990).

Si el pescado en hielo es almacenado en condiciones de anaerobiosis o en una atmósfera de CO₂, el número normal de las bacterias psicrotrófas, como la S. putrefaciens y Pseudomonas, es generalmente mucho menor (10⁶ - 10⁷ ufc/g) que en pescado almacenado en condiciones de aerobiosis. Sin embargo, el nivel de bacterias con carácter psicrófilo como P. phosphoreum alcanza las 10⁷ - 10⁸ ufc/g cuando el pescado está deteriorado (Dalgaard et al., 1993).

La composición de la microflora también cambia dramáticamente durante el almacenamiento. De esta forma, después de 1 - 2 semanas de almacenamiento aeróbico en hielo, la flora está constituida casi exclusivamente por Pseudomonas spp. y S. putrefaciens. Esto, se cree, es debido a su relativo corto tiempo de generación a temperaturas de enfriamiento (Morita, 1975; Devaraju y Setty, 1985), este hecho ha sido confirmado por numerosos estudios llevados a cabo en peces de aguas tropicales y de aguas templadas. A temperatura ambiente (25 °C), la microflora en el punto de deterioro está dominada por Vibrionáceas mesofílicas y, particularmente si el pescado proviene de aguas contaminadas, por Enterobacteriáceas.

Debe efectuarse una clara distinción entre los términos flora del deterioro y bacterias del deterioro, dado que el primero describe meramente las bacterias presente en el pescado cuando está deteriorado, mientras que el último se refiere al grupo específico que produce olores y sabores desagradables asociados con el deterioro. Una gran parte de las bacterias presentes en el pescado deteriorado no desempeñan ningún papel en lo absoluto en el deterioro (Figura 5.9). Cada producto pesquero posee sus propias bacterias específicas del deterioro y es el número de estas bacterias, y no el número total de microorganismos, lo que guarda relación con la duración en almacén del producto. En la Figura 5.10, se muestra que el tiempo de vida útil remanente del bacalao en hielo puede ser pronosticado mediante el tiempo de detección conductométrico (en caldo de OTMA), el cual se correlaciona inversamente con el número de puentes de hidrógeno de sulfuro producidos por la acción bacteriana.

No es una tarea fácil determinar, entre las bacterias aisladas del pescado deteriorado, las verdaderas responsables del deterioro, pues se requieren extensos estudios sensoriales, microbiológicos y químicos. En primer lugar deben ser estudiados y cuantificados los cambios sensoriales, microbiológicos y químicos que ocurren durante el almacenamiento, incluyendo la determinación del nivel de un determinado componente químico que se correlacione con deterioro (indicador químico de deterioro). En segundo lugar, se aíslan las bacterias presentes al momento del rechazo sensorial. Poblaciones de bacterias puras y mezcladas se inoculan en sustratos estériles de pescado a fin de evaluar su potencial de deterioro, es decir, su habilidad para producir cambios sensoriales (olores desagradables) y químicos típicos del producto deteriorado. Finalmente, las cepas seleccionadas son examinadas para evaluar su actividad de deterioro, es decir, si su tasa de crecimiento y su producción cualitativa y cuantitativa de olores desagradables son similares a las mediciones en el producto deteriorado (Dalgaard, 1993).

Figura 5.9 Cambios en el recuento total y en las bacterias específicas del deterioro durante el almacenamiento (modificado según Dalgaard (1993))

Figura 5.10 Comparación del tiempo de vida remanente y el tiempo de detección en caldo de OTMA (Jorgensen et al., 1988)

El último paso es particularmente importante, debido a que algunas bacterias pueden producir los compuestos químicos asociados con el deterioro pero son incapaces de hacerlo en cantidades significativas y, por lo tanto, no constituyen bacterias específicas del deterioro. Durante el almacenamiento aeróbico se requieren niveles de 10⁸ - 10⁹ ufc/g de bacterias específicas del deterioro para ocasionar el deterioro. El deterioro del pescado empacado se observa a niveles muy por debajo de 10⁷ ufc de P. phosphoreum por gramo. Este nivel relativamente bajo es debido probablemente al gran tamaño (5 µm) de la bacteria, lo cual origina un mayor rendimiento de por ejemplo la TMA por célula (Dalgaard, 1993).

El potencial y la actividad de deterioro pueden ser medidos en algunos sustratos estériles de pescado como: extracto crudo de pescado (Lerke et al., 1963), extracto de pescado esterilizado por calor (Castell y Greenough, 1957; Gram et al., 1987; Dalgaard, 1993) o en bloques de músculo de pescado estériles (Herbert et al., 1971). Este último es el más complicado pero también es el que proporciona resultados comparables al producto. Si se escoge cualquiera de los extractos del pescado, es importante que la tasa de crecimiento de la bacteria del deterioro en el sistema modelo sea igual a la tasa de crecimiento en el producto.

También puede emplearse una prueba cualitativa para medir la habilidad de la bacteria en producir H2S o reducir OTMA, cuando la flora del deterioro es tamizada en la búsqueda de las bacterias potenciales del deterioro. Un medio donde la reducción del OTMA a TMA puede observarse como el cambio de color de un indicador redox, y la formación de H2S es evidente debido al precipitado negro de FeS desarrollado para este propósito (Gram et al., 1987).

Shewanella putrefaciens ha sido identificada como la bacteria específica del deterioro del pescado de aguas templadas almacenado aeróbicamente en hielo. Si este producto se empaca al vacío, P. phosphoreum participa en el deterioro y pasa a ser la bacteria específica del deterioro del pescado empacado en presencia de CO₂ (véase Sección 6.3). La flora del deterioro, del pescado tropical de mar almacenado en hielo, está compuesta casi exclusivamente de Pseudomonas spp. y S. putrefaciens. Algunas Pseudomonas spp. son específicas del deterioro del pescado tropical de agua dulce almacenado en hielo (Lima dos Santos, 1978; Gram et al., 1990) y conjuntamente con S. putrefaciens, son también las causantes del deterioro del pescado marino tropical almacenado en hielo (Gillespie y MacRae, 1975; Gram, 1990).

A temperatura ambiente, las aeromonas móviles son específicas del deterioro del pescado de agua dulce, almacenado aeróbicamente (Gorzyka y Pek Poh Len, 1985; Gram et al., 1990). Barile et al. (1985), demostraron que una gran proporción de la flora en caballa almacenada a temperatura ambiente, estaba constituida por S. putrefaciens, indicando que esta bacteria quizá participa también en el deterioro.

El Cuadro 5.5 proporciona un panorama de las bacterias del deterioro específicas de los productos pesqueros frescos almacenados en hielo y temperatura ambiente.

Cuadro 5.5 Flora dominante y bacterias específicas del deterioro, durante el deterioro de pescado blanco fresco (bacalao) (Huss, 1994)

Temperatura de almacenamiento	Atmósfera de envasado	Microflora dominante	Organismos específicos del deterioro (OED)	Referencias
0°C	Aeróbica	Bacilos Gram negativos psicrotróficos, no fermentativos (Pseudomonas spp., S. putrefaciens, Moraxella, Acinetobacter)	S. putrefaciens Pseudomonas3	2, 3, 4, 9
	Vacío	Bacilos Gram negativos, psicrotróficos o con carácter psicrófilo (S. putrefaciens, Photobacterium)	S. putrefaciens P. phosphoreum	1,9
	EAM¹	Bacilos Gram negativos fermentativos con carácter psicrófilo (Photobacterium) Bacilos Gram negativos no fermentativos psicrotróficos (1-10% de la flora: Pseudomonas, S. putrefaciens) Bacilos Gram positivos (BAL2)	P. phosphoreum	1,7
5°C	Aeróbica	Bacilos Gram negativos psicrotróficos (Vibrionáceas, S. putrefaciens)	Aeromonas spp. S. putrefaciens	10
	Vacío	Bacilos Gram negativos psicrotróficos (Vibrionáceas, S. putrefaciens)	Aeromonas spp. S. putrefaciens	10
	EAM	Bacilos Gram negativos psicrotróficos (Vibrionáceas)	Aeromonas spp.	6
20 - 30 °C	Aeróbica	Bacilos Gram negativos mesófilos fermentativos (Vibrionáceas, Enterobacteriáceas)	Aeromonas spp. móvil (A. Hydrophila)	2, 4, 5, 8

1) Envasado en atmósfera modificada (que contiene CO₂)
2) BAL = Bacterias acidolácticas
3) En el pescado capturado en aguas tropicales o en agua dulce suele predominar el deterioro causado por Pseudomonas spp.

Referencias: 1) Barile et al. (1985); 2) Dalgaard et al. (1993); 3) Donald y Gibson (1992); 4) Gorczyca y Pek Poh Len (1985); 5) Gram el al., (1987); 6) Gram et al., (1990); 7) Gram y Dalgaard (comunicación personal); 8) Jorgensen y Huss (1989); 9) Lima dos Santos (1978); 10) van Spreekens (1977)

Cambios bioquímicos inducidos por el crecimiento bacteriano durante el almacenamiento y el deterioro

Al comparar los compuestos químicos desarrollados durante el deterioro natural del pescado y el pescado estéril, se demuestra que la mayoría de los componentes volátiles son producidos por bacterias (Shewan, 1962) según se observa en la Figura 5.11. Estos incluyen trimetilamina, compuestos sulfurosos volátiles, aldehídos, cetonas, ésteres, hipoxantina, así como también otros compuestos de bajo peso molecular.

Los sustratos para la producción de volátiles son los carbohidratos (como el lactado y la ribosa), los nucleótidos (como la inosina monofosfato y la inosina) y otras moléculas de nitrógeno no proteico (NNP). Los aminoácidos son sustratos particularmente importantes para la formación de sulfitos y amoniaco.

Figura 5.11 Cambios en los compuestos extractables que contienen nitrógeno en (a) el deterioro y (b) la autólisis de músculo de bacalao (Shewan, 1962)

Los microorganismos obtienen mucha más energía de la oxidación aeróbica que de la fermentación anaeróbica; así, la completa oxidación de 1 mol de glucosa (u otra hexosa) vía ciclo de Krebs rinde 6 moles de CO₂ y 36 moles de ATP. Por el contrario, la fermentación de 1 mol de glucosa rinde sólo 2 moles de ATP y dos moles de ácido láctico. El crecimiento aeróbico inicial en pescado es dominado por bacterias que utilizan carbohidratos como sustrato y oxígeno como aceptor terminal de electrones, con la concomitante producción de CO₂ y H₂O.

Reducción del Oxido de Trimetilamina (OTMA)

El crecimiento de bacterias consumidoras de oxígeno ocasiona la formación de nichos anaeróbicos o microaerofílicos en el pescado. Esto sin embargo no necesariamente favorece el crecimiento de bacterias anaeróbicas. Algunas de las bacterias presentes en el pescado son capaces de llevar a cabo respiración (con la ventaja del ATP) empleando otras moléculas como receptor final del electrón. Es típico de muchas bacterias específicas del deterioro del pescado emplear el OTMA como aceptor terminal de electrones durante la respiración anaeróbica. El componente reducido, la TMA; uno de los compuestos dominantes del pescado deteriorado, tiene el olor típico del pescado. El nivel de TMA encontrado en pescado fresco rechazado por un panel sensorial varía dependiendo de la especie de pescado, pero generalmente se encuentra alrededor de los 10-15 mg TMA-N/100 g en pescado almacenado aeróbicamente y en un nivel de 30 mg TMA-N/100 g en bacalao empacado (Dalgaard et al., 1993).

La reducción del OTMA está generalmente asociada con géneros de bacterias típicos del ambiente marino (Alteromonas, Photobacterium, Vibrio y S. putrefaciens), pero también es llevada a cabo por Aeromonas y bacterias intestinales de las Enterobacteriáceas. La reducción del OTMA ha sido estudiada en bacterias fermentativas, anaerobias facultativas, como E. coli (Sakaguchi et al., 1980) y Proteus spp. (Stenberg et al., 1982) como también en la bacteria no fermentativa S. putrefaciens (Easter et al., 1983; Ringo et al., 1984). Durante el crecimiento aeróbico, S. putrefaciens emplea el ciclo de Krebs para producir los electrones que posteriormente son canalizados a través de la cadena respiratoria. Ringo et al. (1984) proponen que durante la respiración anaeróbica S. putrefaciens también utiliza todo el ciclo de Krebs (Figura 5.12), mientras recientemente se ha demostrado que en la respiración anaeróbica de S. putrefaciens, sólo utiliza una parte del ciclo de Krebs (Figura 5.13) y los electrones son generados también por otra ruta metabólica, denominada la ruta de la serina (Scott y Nealson, 1994). S. putrefaciens puede emplear una variedad de fuentes de carbono como sustrato en su respiración anaeróbica dependiente de OTMA, incluyendo formato y lactato. Compuestos como acetato y succinato empleados en la respiración del oxígeno no pueden ser empleados cuando el OTMA es el aceptor terminal de electrones (DiChristina y DeLong, 1994), por el contrario, el acetato es uno de. los productos del la reducción anaeróbica del OTMA (Ringo et al., 1984; Scott y Nealson, 1994).

Figura 5.12 Reducción anaeróbica del OTMA por S. putrefaciens (anteriormente Alteromonas) según propuesta de Ringo et al. (1984)

Figura 5.13 Ruta del carbón durante la anaerobiosis propuesta para S. putrefaciens (Scott y Nealson, 1994)

Por el contrario, los azúcares y el lactato son los principales sustratos generadores de electrones cuando el OTMA es reducido por Proteus spp. La reducción está acompañada por la producción de acetato como producto principal (Kjosbakken y Larsen, 1974).

El OTMA es un compuesto típico de los peces marinos, según se mencionó en la Sección 4.4, y recientemente ha sido reportado que también algunos peces de agua dulce contienen altas cantidades de OTMA (Anthoni et al., 1990). Sin embargo, la TMA no es necesariamente un compuesto característico durante el deterioro de este tipo de pescado porque el deterioro es debido a Pseudomonas spp. (Gram et al., 1990).

En muchas especies de pescado el desarrollo de la TMA es paralelo a la producción de hipoxantina. La hipoxantina, según lo descrito en la Sección 5.2, puede ser formada por la descomposición autolítica de nucleótidos, pero también puede ser formada por bacterias; la tasa de formación por la acción bacteriana es mayor que por autólisis. Tanto Jorgensen et al. (1988) como Dalgaard (1993) demostraron una correlación linear entre el contenido de TMA e hipoxantina durante el almacenamiento en hielo de bacalao empacado (Figura 5.14). Algunas de las bacterias del deterioro producen hipoxantina a partir de inosina o inosina monofosfato, incluyendo Pseudomonas spp. (Surette et al., 1988), S. putrefaciens (van Spreekens, 1977; Jorgensen y Huss, 1989; Gram, 1989) y P. phosphoreum (van Spreekens, 1977).

En el bacalao y en otros gádidos, hasta que ocurre el deterioro, la TMA constituye la mayor parte de las denominadas bases volátiles totales; BVT (también conocidas como nitrógeno volátil total, NVT). Sin embargo, en el pescado deteriorado el suministro de OTMA decae, la TMA alcanza su máximo nivel y los niveles de NVT continúan incrementando debido a la formación de NH₃ y otras aminas volátiles. En las primeras semanas del almacenamiento en hielo también se forma un poco de amoniaco debido a la autólisis. En algunos pescados que no contienen OTMA, o en los cuales el deterioro es debido a una flora no reductora de OTMA, se observa un leve incremento en las BVT durante el almacenamiento, probablemente como resultado de la desaminación de aminoácidos.

Figura 5.14 Relación entre el contenido de TMA e Hx durante el almacenamiento de bacalao empacado en hielo (Dalgaard et al., 1993)

Los compuestos sulfurados volátiles son componentes típicos del pescado deteriorado y la mayoría de las bacterias identificadas como bacterias específicas del deterioro producen uno o algunos sulfuros volátiles. S putrefaciens y algunas Vibrionaceae producen H₂S a partir del aminoácido sulfurado 1-cisteína (Stenstroem y Molin, 1990; Gram et al., 1987). Por el contrario, ni Pseudomonas o P. phosphoreum producen cantidades significativas de H2S. De esta forma el sulfuro de hidrógeno, compuesto típico del deterioro del bacalao almacenado aeróbicamente en hielo, no se produce durante el deterioro del pescado empacado en CO₂ (Dalgaard et al., 1993). El metilmercaptano (CH₃SH) y el dimetilsulfuro ((CH₃)2S) son formados a partir del otro aminoácido sulfurado, la metionina. La taurina, que también contiene sulfuro, se presenta como aminoácido libre en muy altas concentraciones en el músculo del pescado. Este aminoácido desaparece del músculo del pescado durante el almacenamiento (Figura 5.11), pero debido más al goteo que al ataque bacteriano (Herbert y Shewan, 1975). En la Figura 5.15 se muestra la formación de compuestos en el bacalao deteriorado naturalmente, comparado con el músculo estéril.

Los compuestos sulfurados volátiles tienen un olor muy desagradable y pueden ser detectados hasta en niveles de ppb, incluso estas mínimas cantidades tienen un efecto considerable en la calidad.

Ringo et al. (1984) han demostrado que la cisteína es utilizada como sustrato en el ciclo de Krebs cuando los electrones son transferidos al OTMA, de este modo la formación de H₂S y TMA son hasta cierto punto reacciones vinculadas (Figura 5.12).

Figura 5.15 Producción de H₂S, CH₃SH y (CH₃)₂S, en filetes de bacalao deteriorados naturalmente y en bloques de músculo estéril (Herbert y Shewan, 1976)

Contrario al deterioro en hielo por S. putrefaciens y al deterioro a temperatura ambiente por Vibrionaceae dominados por la producción de H2S y TMA, el deterioro causado por Pseudomonas spp, está caracterizado por la ausencia de estos compuestos (Gram et al., 1989, Gram et al., 1990). El deterioro del pescado almacenado en hielo por Pseudomonas genera olores y sabores desagradables arrutados, a podrido y a sulfuro. Las Pseudomonas spp. producen un número de compuestos volátiles, como aldehídos, cetonas, ésteres y sulfuros (Edwards et al., 1987; Miller et al., 1973^a, 1973^b). Sin embargo, se desconoce el compuesto específico responsable de los típicos olores desagradables (Cuadro 5.6). Los olores afrutados desagradables producidos por Pseudomonas fragi se originan a partir de los monoaminoácidos y los aminoácidos monocarboxílicos.

Cuadro 5.6 Compuestos típicos del deterioro, producidos durante el deterioro del pescado fresco almacenado aeróbicamente, o empacado en hielo o a temperatura ambiente

Organismo específico del deterioro	Compuesto típico del deterioro
Shewanella putrefaciens	TMA, H2S, CH3SH, (CH3)2S y Hx
Photobacterium phosphoreum	TMA, Hx
Pseudomonas spp.	Cetonas, aldehídos, ésteres, sulfuros no-H2S
Vibrionaceae	TMA, H2S
Anaeróbicos deteriorativos	NH3, ácidos: acético, butírico y propiónico

Según se mencionó anteriormente, el nivel de las BVT continúa incrementando incluso después que la TMA ha alcanzado su máximo. Lo anterior es debido a la proteólisis que se inicia cuando algunos de los aminoácidos libres han sido utilizados. Lerke et al. (1967) separaron extracto de pescado en fracciones proteicas y no proteicas, e inocularon bacterias del deterioro en cada fracción y en el extracto total. La fracción no proteica del extracto de pescado se deterioró como todo el extracto, mientras que en la fracción proteica del extracto sólo se detectaron leves olores desagradables. Aunque, algunos autores han empleado el número de bacterias proteolíticas como un indicador del deterioro, se debe concluir que el volumen de la fracción proteica es de menor importancia en el deterioro del pescado fresco.

Algunos de los compuestos típicos formados por las bacterias durante el deterioro del pescado se muestran en el Cuadro 5.7, conjuntamente con los sustratos empleados para su formación.

Cuadro 5.7 Sustratos y compuestos, de olores y sabores desagradables, producidos por las bacterias durante el deterioro del pescado

Sustrato	Compuestos producidos por la acción bacteriana
OTMA	TMA
cisteína	HsS
metionina	CH3SH, (CH3)2S
carbohidratos y lactato	acetato, CO2, H2O
inosina, IMP	hipoxantina
aminoácidos (glicina, serina, leucina)	ésteres, cetonas, aldehídos
aminoácidos, urea	NH3

La formación de TMA está acompañada por la formación de amoniaco durante el almacenamiento anóxico del arenque y la caballa (Haaland y Njaa, 1988). El almacenamiento anaeróbico prolongado del pescado ocasiona una vigorosa producción de NH₃, debido a la degradación posterior de aminoácidos y a la acumulación de ácidos grasos como los ácidos acético, butírico y propiónico. Se determinó que los más fuertes productores de NH₃ son anaerobios obligados pertenecientes a la familia Bacteroidaceae género Fusobacterium (Kjosbakken y Larsen, 1974; Storroe et al., 1975, 1977). Estos organismos sólo crecen en el extracto de pescado deteriorado y tienen muy poca o ninguna actividad proteolítica, por lo cual emplean proteínas ya hidrolizadas.

Durante el almacenamiento en hielo del pescado graso fresco, los cambios en la fracción lipídica son causados casi exclusivamente por la acción química, por ejemplo: la oxidación, por cuanto el ataque bacteriano en la fracción lipídica contribuye muy poco al perfil de deterioro. Durante el almacenamiento del pescado ligeramente preservado, la hidrólisis lipídica causada por bacterias puede ser parte del perfil de deterioro.