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close this bookEl pescado fresco: su calidad y cambios de su calidad (1999)
close this folder8. EVALUACION DE LA CALIDAD DEL PESCADO
View the document(introduction...)
View the document8.1 Métodos sensoriales
View the document8.2 Métodos bioquímicos y químicos
View the document8.3 Métodos físicos
View the document8.4 Métodos microbiológicos

8.4 Métodos microbiológicos

La finalidad del análisis microbiológico de los productos pesqueros es evaluar la posible presencia de bacterias u organismos de importancia para la salud pública, y proporcionar una impresión sobre la calidad higiénica del pescado, incluyendo el abuso de temperatura e higiene durante la manipulación y el procesamiento. En general, los resultados microbiológicos no proporcionan ninguna información sobre la calidad comestible y la frescura del pescado. Sin embargo, según lo señalado en los Capítulos 5 y 6, el número de bacterias específicas del deterioro está relacionado con el tiempo de duración remanente y esto puede ser predecido a partir del número de bacterias (véase Figura 5.8).

Los análisis bacteriológicos tradicionales son laboriosos, costosos, consumen tiempo y requieren de personal capacitado en la ejecución e interpretación de los resultados. Es recomendable que este tipo de análisis sea limitado en número y en extensión. Durante la última década han sido desarrollados varios métodos microbiológicos rápidos y procedimientos automatizados, que pueden ser empleados cuando se debe analizar un gran número de muestras.

Recuento total

Este parámetro es sinónimo de Recuento Total de Aeróbicos (RTA, del inglés Total Aerobic Count, TAC) y Recuento Estándar en Placa (REP, del inglés Standard Plate Count, SPC). El recuento total representa, si se efectúa mediante métodos tradicionales, el número total de bacterias capaces de formar colonias visibles en un medio de cultivo a una temperatura dada. Este dato es difícilmente un buen indicador de la calidad sensorial o de la expectativa de duración del producto (Huss et al., 1974). En percha del Nilo, almacenada en hielo, el recuento total fue de 109 ufc/g por días antes de que el pescado mera rechazado (Gram et al., 1989). En productos pesqueros ligeramente preservados los recuentos altos prevalecen por largos períodos de tiempo antes de ser rechazados. Si el recuento es efectuado luego de un muestreo sistemático y un profundo conocimiento de la manipulación del pescado antes del muestreo (condiciones de temperatura, empaque, entre otros), puede proporcionar una medida comparativa del grado general de contaminación bacteriana y de higiene aplicada. Sin embargo, también debe tomarse en consideración que no existe correlación entre el recuento total y la presencia de cualquier bacteria de importancia para la salud pública. Un resumen de los diferentes métodos empleados para el pescado y los productos pesqueros se muestra en el Cuadro 8.4.

El sustrato más comúnmente usado para los recuentos totales continúa siendo el agar para recuento en placa (ARP), del inglés “plate count agar” (PCA). Sin embargo, cuando se examinan diferentes tipos de productos pesqueros, un agar más rico en nutrientes (Agar hierro, Lyngby, Oxoid) proporciona recuentos significativamente mayores que el ARP (Gram, 1990). Además, el agar hierro proporciona mayor número de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno, las cuales constituyen bacterias específicas del deterioro en algunos productos pesqueros. Las temperaturas de incubación iguales o superiores a 30 °C son inapropiadas cuando se examinan productos pesqueros mantenidos a temperaturas de enfriamiento. Es relevante emplear siembra en profundidad y 3-4 días de incubación a 25 °C cuando se examinan productos donde los organismos más importantes son psicrótrofos, mientras los productos donde los psicrofílicos Photobacterium phosphoreum aparecen deberán ser analizados por siembra en superficie y temperatura máxima de incubación a 15 °C.

Se han efectuado algunos intentos con el fin de facilitar los procedimientos para la determinación del contenido de bacterias (Fung et al., 1987). Tanto Redigel (RCR Scientific) como Petrifilmä SM (Compañía 3M), son agares deshidratados con un agente gelificante al cual se adhiere directamente la muestra. La principal ventaja del Redigel y el Petrifilm, comparados con los recuentos tradicionales en placa (en adición al costo), es su fácil manipulación. Sin embargo, todos los métodos basados en agar comparten una desventaja común debido al prolongado período de incubación requerido.

El examen microscópico del alimento es una forma rápida de estimar los niveles bacterianos. Mediante un microscopio de contraste de fase, el nivel de bacterias en una muestra puede ser determinado dentro de una unidad logarítmica. Una célula por campo de visión equivale a aproximadamente 5.105 ufc/ml, a una magnificación de 1000x. La tinción de las células con naranja acridina y su detección mediante microscopía de fluorescencia ha ganado una amplia aceptación, al igual que la técnica epifluorescente de filtración directa (TEFD; del inglés: direct epifluorescence filter technique, DEFT). Los métodos microscópicos son muy rápidos, sin embargo, la baja sensibilidad debe ser considerada como su mayor desventaja.

El número de bacterias en el alimento también ha sido estimado midiendo la cantidad de adenosina trifosfato (ATP) de origen bacteriano (Sharpe et al., 1970), o midiendo la cantidad de endotoxinas (bacterias Gram-negativas) mediante la prueba Limulus amoebocito lisato LAL (Gram, 1992). El primero es muy rápido pero existen dificultades en separar el ATP bacterial del ATP de origen somático.

Cuadro 8.4 Métodos para la determinación del contenido de bacterias en productos pesqueros

Método

Temperatura (°C)

Incubación

Sensibilidad (ufc/g)

Recuento en placa o Agar hierro

15-25

3-5 días

10

“Redigel’/“Petrifilmä SM”

15-25

3-5 días

10

Microcolonias - TEFD

15-30

3-4 horas

104 -105

TEFD

-

30 min.

104 -105

ATP

-

1 hora

104 -105

Prueba Limulus lisato (LAL)

-

2-3 horas

104 -104

Microcalorimetría/

15-25

4-40 horas

10

Reducción colorimétrica

Conductancia/capacitancia

Algunos métodos (microcalorimetría, reducción colorimétrica, conductancia y capacitancia) usados para la estimación rápida del número de bacterias se basan en la toma de una muestra, incubación a altas temperaturas (20-25 °C) y detección de una señal determinada. En el método microcalorimétrico, el calor generado por la muestra es comparado con un control estéril. La determinación de la conductancia y la capacitancia consiste en la medición y registro de los cambios en las propiedades eléctricas de la muestra, comparada con una muestra control estéril. El tiempo que transcurre antes de que ocurra algún cambio significativo en el parámetro medido (calor, conductancia, entre otros) se denomina Tiempo de Detección (TD). El tiempo de detección está inversamente relacionado al número inicial de bacterias, por ejemplo, una reacción temprana indica un alto recuento bacteriano en la muestra. Sin embargo, a pesar de que la señal obtenida es inversamente proporcional al recuento bacteriano efectuado mediante agar, sólo una pequeña fracción de la microflora genera la señal y deben tomarse precauciones en la selección de la temperatura de incubación y el sustrato.

Bacterias del deterioro

El número total de bacterias en el pescado raramente indica calidad sensorial o duración en almacén (Huss et al., 1974). Sin embargo, se reconoce que ciertas bacterias son las principales causantes del deterioro (véase Sección 5.3). Diferentes sustratos ricos en peptona y que contienen citrato férrico, han sido usados para la detección de bacterias productoras de H2S como la Shewanella putrefaciens, las cuales aparecen como colonias negras debido a la precipitación del FeS (Levin, 1968; Gram et al., 1987). El deterioro ambiental es causado generalmente por miembros de la familia Vibrioanaceae, los cuales también forman colonias negras en agar hierro al cual se añade una fuente de sulfato orgánico (como el Agar Hierro, Lyngby). No existe un medio selectivo o indicativo para Pseudomonas spp., contaminante de algunos pescados de agua dulce tropical, ni para Photobacterium phosphoreum que contamina el pescado empacado. En el Laboratorio Tecnológico de Lyngby, actualmente se desarrolla un método basado en conductancia para la detección específica de P. phosphoreum (Dalgaard, comunicación personal). La presencia, o ausencia, de bacterias patógenas es generalmente evaluada mediante métodos basados en técnicas inmunológicas o de biología molecular. Estas técnicas pueden también ser desarrolladas para bacterias específicas del deterioro; el Laboratorio Tecnológico ha estado actualmente investigando el uso de anticuerpos específicos para S. putrefaciens (Fonnesbech et al., 1993). También ha sido desarrollada una prueba de genes, específica para S. putrefaciens, pero no ha sido probada en productos pesqueros (DiChristina y DeLong, 1993).

Reacciones de deterioro

Algunas reacciones de deterioro pueden ser usadas para evaluar la situación bacteriológica de los productos pesqueros. Según lo descrito anteriormente, han sido desarrollados agares en los cuales es posible el recuento de organismos productores de H2S. Durante el deterioro del pescado magro de carne blanca, una de las principales reacciones de deterioro es la reducción bacteriana del óxido de trimetilamina a trimetilamina (Liston, 1980; Hobbs y Hodgkiss, 1982). Cuando el OTMA es reducido a TMA, ocurren algunos cambios físicos: disminuye el potencial redox, el pH incrementa y la conductancia eléctrica incrementa. La medición de estos cambios, en un sustrato rico en OTMA inoculado con la muestra, puede ser usada para evaluar el nivel de organismos con potencial de deterioro; así, cuanto más rápido ocurre el cambio mayor es el nivel de organismos del deterioro.

Algunos autores han inoculado una cantidad conocida de muestra en un sustrato con OTMA y han registrado el tiempo transcurrido hasta que ocurre un cambio significativo en la conductancia (Gibson et al., 1984; Gram, 1985; Jorgensen et al., 1988). Se ha encontrado que el tiempo de detección es inversamente proporcional al número de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno, en pescado fresco almacenado aerobicamente; una estimación rápida de su número puede ser suministrada en 8-36 horas.

Los cambios del potencial redox en un sustrato que contiene OTMA pueden ser registrados por electrodos u observando el color de un indicador redox (Huss et al., 1987); y también mediante determinaciones conductimétricas, el tiempo transcurrido hasta que se registre un cambio significativo es inversamente proporcional a la cantidad inicial de bacterias.

Bacterias patogénicas

Algunas bacterias patogénicas pueden estar presentes en el ambiente o contaminar el pescado durante la manipulación. Una descripción detallada de estos organismos, su importancia y métodos de detección es proporcionada por Huss (1994).