M.O.S.8: Test biochimiques pour l’identification de M. mycoides subsp. mycoides

I. Test de la fermentation du glucose

1. Reconstituer un flacon de vaccin à l’aide d’un volume d’eau distillée stérile froide égale au volume initial de vaccin.

2. Ensemencer la suspension vaccinale dans des tubes de milieu glucose (voir MOS 1) à raison d’une partie de suspension de vaccin pour 9 parties de milieu. (Au Panvac, 2 tubes contenant chacun 2.25 ml de milieu sont inoculés avec 250 µl de suspension vaccinale).

3. Un témoin positif (par exemple M. bovirhinis) et un témoin négatif (le liquide de reconstitution du vaccin) doivent être incorporés dans le test.

4. Incuber les tuber à 37°C pendant 10 jours au maximum.

5. Une réaction positive est indiquée par un changement de couleur du milieu, qui vire du rosé au jaune. Un virage analogue doit se produire dans le tube témoin positif. Il ne doit pas y avoir de virage de couleur de l’indicateur coloré dans les tubes témoins négatifs.

6. Le test est valable s’il n’y a pas de changement de couleur dans les tubes témoins négatifs et si la couleur du milieu vire du rosé au jaune dans les tubes témoins positifs.

II. Test de l’hydrolyse de l’arginine

1. Ensemencer deux tubes de milieu à l’arginine (MOS1) avec la suspension vaccinale reconstituée comme dans le test de fermentation du glucose.

2. Un témoin positif (par exemple M. argininï) et un témoin négatif (le liquide de reconstitution du vaccin) doivent être incorporés dans le test.

3. Les tubes sont mis à incuber en milieu aérobie à 37°C pendant 10 jours.

4. Une réaction positive est indiquée par un virage du milieu qui devient rouge violacé foncé. Le test est valable si la couleur du milieu témoin positif vire au violet foncé et s’il n’y a pas de changement de couleur dans les tubes témoins négatifs.

III. Test de la réduction du tétrazolium

A. Méthode sur bouillon de culture

1. Ensemencer 4 tubes de milieu d’étude de la réduction du tétrazolium (MOS1) comme dans le test de la fermentation du glucose. Constituer 2 tubes témoins positifs ensemencés avec une suspension de M. bovirhinis, et 2 tubes témoins négatifs ensemencés avec le liquide de reconstitution du vaccin.

2. Incuber à 37°C pendant 10 jours une moitié de chaque type de tubes ensemencés en aérobiose et l’autre moitié en anaérobiose et les deux restants en conditions anaérobies à 37°C pendant 10 jours.

3. Un test positif de réduction du tétrazolium est indiqué par le virage de l’indicateur coloré du milieu d’épreuve au rouge brique.

4. Le test est valable si la couleur de l’indicateur du milieu témoin positif vire au rouge brique et s’il n’y a pas de changement de couleur dans les tubes témoins négatifs.

B. Méthode sur plaque de gélose

Verser une sur-couche de gélose contenant le sel de tétrazolium sur les colonies de mycoplasmes sur gélose. Examiner la plaque de gélose pour y rechercher le virage caractéristique indiquant la réduction du tétrazolium.

1. Ensemencer le vaccin à tester dans 2 boites de gélose mycoplasme comme décrit pour l’essai de sensibilité à la digitonine (MOS 4). Mettre à incuber une plaque en conditions aérobies et l’autre en conditions anaérobies à 37°C pendant 6 à 10 jours.

2. Préparer une suspension de gélose à *** 1 pi 00 (p/v) pH 7.2 dans de l’eau distillée. Faire fondre la gélose à l’autoclave à 110°C pendant 10 minutes. Equilibrer la température de la gélose fondue à 50°C au bain marie. Préparer une solution à 0.2 pour cent p/v de chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium dans de l’eau distillée. Stériliser la solution par filtration sur membrane filtrante à pores de 0.2 µm puis équilibrer sa température à 50°C.

3. Mélanger des volumes égaux de gélose fondue et de solution saline au tétrazolium. Etaler 4 ml de ce mélange à la surface de la gélose portant les colonies de mycoplasmes à étudier.

4. Incuber la boite en anaérobiose à 37°C. Examiner la plaque 1, 2 et 3 heures après l’incubation. Un test positif de réduction du tétrazolium est indiqué par l’apparition d’une coloration rouge brique autour des colonies de mycoplasmes. Le test est valable si on observe une coloration rouge brique sur la boite témoin positive et s’il n’y a pas de modification de couleur sur la boite témoin négative.

IV. Test de détection de la phosphatase

1. Reconstituer le contenu d’un flacon de vaccin en utilisant un volume d’eau distillée stérile froide équivalant au volume de remplissage du flacon.

2. Ensemencer une gélose à la phosphatase (MOS1) avec 0.2 ml de la suspension vaccinale reconstituée. Dans ce test le contrôle positif est une boite de gélose à la phosphatase ensemencée avec M. mycoides subsp. mycoides (Grande Colonie), tandis que le témoin négatif est une boite ensemencée avec l’eau distillée ayant servi à la reconstitution du vaccin.

3. Incuber les boites ensemencées, préalablement placées dans une chambre humide, à 37°C pendant 5 à 10 jours.

4. Examiner les boites au microscope inversé (16x) pour y détecter l’apparition de colonies de mycoplasmes. Lorsque les colonies sont bien visibles (en général 6 jours après l’incubation), verser 1 ml de solution de NaOH ou KOH à 40 pour cent sur chaque plaque de gélose.

5. Une activité phosphatasique est indiquée par l’apparition d’une coloration rose-rouge autour des colonies de mycoplasmes dans les 30 secondes qui suivent l’addition de la solution alcaline. Le test est valable s’il apparaît dans boite témoin positive une coloration rouge autour des colonies de mycoplasmes et s’il n’y a pas de changement de couleur dans la boite témoin négative.

V. Le test de liquéfaction du sérum coagulé

1. Reconstituer le vaccin comme décrit pour le test de recherche de la phosphatase. Ensemencer 0.25 ml de la suspension vaccinale dans un tube à vis contenant 2.25 ml de milieu complet pour la numération ou de milieu de Gourlay (MOS1) qui est ensuite mis à incuber à 37°C pendant 2-3 jours.

2. A l’aide d’une anse bactériologique ensemencer par strie la culture obtenue sur la pente du milieu au sérum coagulé (MOS1). Le même milieu ensemencé avec une culture de M. mycoides subsp. mycoides (grande colonie) servira de témoin positif. Un autre tube ensemencé avec le milieu de numération ou de Gourlay servira de témoin négatif.

3. Incuber les tubes à 37°C pendant 14 jours. Examiner les tubes de milieu d’épreuve le cinquième, le dixième, puis le quatorzième jours.

4. Une réaction positive de protéolyse est indiquée par l’apparition de rigoles le long des stries d’ensemencement, le milieu devenant transparent et/ou le liquide s’accumulant en bas de la culture inclinée. Ce test est valable si le tube témoin positif présente une réaction positive et si le tube témoin négatif ne présente aucun signe de protéolyse du sérum.

CARACTERES CULTURAUX DE M. mycoides subsp. mycoides

i. Croissance en conditions aérobies	+
ii. Formation d’une pellicule et de taches	-
ni. Fermentation du glucose	+
iv. Hydrolyse de l’arginine	-
v. Réduction du tétrazolium (aérobie/anaérobie)	v/+
vi. Activité de la phosphatase	-/+ (65%/35%)
vii. Liquéfaction du sérum coagulé	-/+
viii. Morphologie des colonies	forme classique de mamelon ou aspect mamillaire
ix. Dimension des colonies	< 0.5 mm en moyenne

NB:
v = variable
+/- = positif ou négatif