M.O.S.5: Test d’inhibition de la croissance pour l’identification de M. mycoides subsp. mycoides

Le test d’inhibition de la croissance est fondé sur le fait qu’un immunsérum spécifique de titre élevé ajouté au milieu de croissance des mycoplasmes empêche la croissance de l’espèce homologue de mycoplasmes contre laquelle l’immunsérum a été produit.

Il existe plusieurs méthodes pour effectuer ce test; elles sont toutes différentes quant au mode d’application ou de présentation de l’immunsérum: on peut en imprégner un disque de papier, celui-ci étant ensuite placé sur la surface d’un milieu solide inoculé, ou bien l’ajouter directement dans des cupules du milieu de culture. On peut aussi en verser directement une goutte à la surface inoculée du milieu de culture.

Quel que soit le mode opératoire choisi, il importe de le valider avant de l’adopter. Au PANVAC, la méthode utilisée, qui est reproductible et est donc recommandée, est celle des cupules de gélose décrite ci-après.

I. Matériel

- Hotte à flux laminaire de classe II
- Tube à essai
- Pipetteurs (10-40 µl, 40-200 µl) et embouts de pipettes
- Incubateur réglé à 37°C ± 0.5°C
- Boîtes de Pétri, 60 x 15 mm
- Microscope inversé ou microscope binoculaire à dissection
- Réfrigérateur
- Emporte-pièces (tube métallique en acier inoxydable) de 5 mm de diamètre
- Aiguille N° 18
- Pipettes (5 et 10 ml)

II. Réactifs et solutions

- Vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine (préalablement titré: MOS 2)

- Antisérum hyperimmun à titre élevé (de lapin ou de singe) contre M. Mycoides subsp. mycoides (petite colonie)

- Eau distillée stérile ou solution saline au tampon phosphate pH 7.2 ou milieu de base de numération (MOS 1)

- Milieu gélose pour mycoplasmes (MOS 1)

III. Mode opératoire

1. Reconstituer un flacon d’un lot de vaccin prétitré avec 10 ml d’eau distillée stérile froide, de solution saline au tampon phosphate ou milieu de base de numération.

2. Préparer une série de dilutions décimales de la suspension de vaccin reconstitué dans le diluant utilisé pour la reconstitution de manière à obtenir approximativement 10⁶ UCC par ml de suspension.

3. Soulever légèrement le couvercle de la boîte de Pétri puis placer 150 µl de la suspension de vaccin dilué à une extrémité de la plaque de gélose. Incliner la plaque de manière que l’inoculum s’étale régulièrement sur toute la surface de la gélose.

4. Le couvercle en place, laisser la plaque sécher dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes.

5. A l’aide d’un tube stérile de métal ou de verre de 5 mm de diamètre, découper une cupule dans le milieu gélose inoculé. On enlève le bouchon découpé en l’aspirant doucement ou on le retire soigneusement à l’aide d’une aiguille stérile N° 18.

6. Ajouter 50 µl d’immunsérum dans la cupule et laisser la plaque couverte dans la hotte à flux laminaire pendant deux ou trois heures pour permettre au sérum de diffuser dans la gélose.

7. Placer la boite de Pétri en position inversée dans une chambre humide, par exemple une boîte à sandwich en matière plastique et mettre à incuber à 37°C.

8. En utilisant un microscope inversé (16x) ou un microscope binoculaire à dissection (20x), examiner la plaque le troisième, le sixième, puis le dixième jour après l’incubation pour observer l’apparition de colonies de mycoplasmes et le développement et l’étendue d’une zone d’inhibition de la croissance autour de la cupule d’immunsérum.

9. Mesurer le diamètre de la zone d’inhibition en millimètres en partant du bord de la cupule le sixième, puis le dixième jour après l’ensemencement.

10. Noter les observations.

IV. Interprétation des résultats

Une zone d’inhibition mesurant au moins 2 mm doit être observée. L’inhibition de la croissance des mycoplasmes peut être totale (absence complète de colonies de mycoplasmes autour de la cupule d’antisérum), ou quasi totale (présence de quelques colonies de mycoplasmes dans la zone d’inhibition) ou elle peut être partielle (diminution relative du nombre et de la taille des colonies dans la zone d’inhibition). L’expérience acquise au PANVAC a montré que le degré d’inhibition dépend de la semence vaccinale de mycoplasmes utilisée. Par exemple, très souvent, la souche T₁SR produit des colonies d’intrusion tandis que ce n’est que rarement le cas avec la souche T₁/44. Lorsque ces colonies d’intrusion apparaissent, elles doivent être clonées et identifiées. S’il est confirmé qu’il s’agit de M. mycoides subsp. mycoides, la préparation vaccinale passe le test d’identité en inhibition de la croissance.