M.O.S.6: Test d’emmunodiffusion en gélose (IDG) pour l’identification de M. mycoides subsp. mycoides

Le test d’IDG est fondé sur la formation de lignes de précipité aux points de rencontre de l’anticorps spécifique et de l’antigène soluble lorsque les réactifs sont à des concentrations optimales. Il est effectué en laissant l’anticorps (sérum) contre la péripneumonie contagieuse bovine et l’antigène (suspension de vaccin à base de mycoplasmes) diffuser en présence l’un de l’autre à partir des cupules découpées dans la gélose solidifiée.

I. Matériel

- Pipetteur (5 - 40 µl) et embouts de pipettes ou pipettes Pasteur
- Boîtes de Pétri (60 x 15 mm)
- Béchers, flacons, pipettes de 5 et 10 ml
- Emporte-pièces du commerce ou confectionné au laboratoire
- Moule
- Pompe péristaltique ou aiguille n° 18
- Chambre humide (polystyrène)

II. Réactifs et solutions salines

- Vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine
- Solution saline au tampon phosphate, pH 7.2
- Sérum hyperimmun anti-M. mycoides subsp. mycoides (PG1)
- Antigène standard de mycoplasmes (suspension de la souche PG1 de M. mycoides subsp. mycoides)

III. Mode opératoire

1. Dévisser le bouchon d’un flacon de gélose pour l’identification de M. mycoides subsp. mycoides et la placer dans un bain d’eau bouillante jusqu’à fusion complète de la gélose.

2. Déposer à l’aide d’une pipette 3 ml de gélose fondue dans chacune des boîtes de Pétri de 60 x 15 mm, placées sur un plan horizontal.

3. Laisser la gélose se solidifier, puis envelopper la boite de Pétri dans une feuille d’aluminium avant de la conserver à +4°C pendant une nuit.

4. Utiliser un moule pour faire une empreinte dans la gélose et un emporte-pièces de diamètre intérieur de 4 mm pour découper une cupule centrale et six cupules périphériques. La distance entre les cupules doit être d’environ 3.5 mm.

5. A l’aide d’une aiguille N° 18 ou d’une pompe à vide et d’une pipette Pasteur, enlever les bouchons de gélose découpée. Numéroter de 1 à 6 les cupules.

6. Reconstituer un flacon par lot de vaccin contre la péripneumonie contagieuse bovine à l’aide d’un volume d’eau distillée stérile froide équivalant au volume de remplissage du flacon. Reconstituer d’une manière analogue un flacon d’antigène standard de mycoplasmes.

7. Déposer 30 µl de sérum anti-PGl dans la cupule centrale.

8. Déposer 30 µl de suspension de PG1 dans chacune des cupules 1 et 4 (témoins positifs de l’antigène).

9. Déposer 30 µl de bouillon de mycoplasmes dans la cupule 3 (témoin négatif).

10. Déposer 30 µl de suspension du vaccin à examiner dans les cupules 2, 5 et 6.

11. Placer les boites de gélose dans une chambre avant de les mettre à incuber à la température ambiante ou à 37° C pendant 18 à 24 heures.

12. Examiner les boites et noter toutes les lignes de précipité entre les cupules d’antisérum et de vaccin. Noter également la relation de ces lignes avec celles formées entre les cupules d’antisérum et les cupules d’antigène témoin positif. Noter les observations.

IV. Interprétation des résultats

Des lignes de précipité doivent être clairement visibles entre la cupule de l’antisérum de référence (cupule centrale) et celles de l’antigène témoin PG1 (cupules 1 et 4). La présence de lignes analogues, entre l’antisérum et les échantillons sous test, qui fusionnent avec celles qui existent entre l’antigène témoin PG1 et l’antisérum de référence, indique une identification positive de M. mycoides subsp. mycoides dans l’échantillon qui passe ainsi le test d’identité en immunodiffusion sur gélose. Le test est valable s’il n’existe pas de ligne de précipité entre l’antisérum de référence et le bouillon mycoplasme. Un résultat négatif indique soit l’absence, soit un titre trop faible de M. mycoides dans le vaccin.